免疫组化是一种利用抗体与抗原特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原的技术。它在医学研究和临床诊断中有着广泛应用，下面为您详细介绍其操作过程。
样本准备是免疫组化的第一步，至关重要。常见的样本包括组织样本和细胞样本。对于组织样本，通常需要进行手术切除或穿刺获取。获取后的组织要尽快固定，常用的固定液是甲醛，它能使组织保持生前的形态结构，防止组织自溶和腐败。固定时间一般为 24 小时左右，时间过短可能固定不充分，时间过长则会影响抗原的活性。固定后的组织要进行脱水处理，通过梯度酒精从低浓度到高浓度依次浸泡，去除组织中的水分，便于后续的透明和浸蜡。透明过程使用透明剂，如二甲苯，使组织变得透明，有利于石蜡的浸入。最后将组织包埋在石蜡中，制成石蜡块，以便后续切片。细胞样本则可以通过涂片、爬片等方式制备，同样需要进行固定处理。
切片制作是将包埋好的石蜡块切成薄片的过程。首先要使用切片机进行切片，切片的厚度一般根据组织类型和观察目的而定，通常为 4 - 6 微米。切片时要注意保持切片的连续性和完整性，避免出现切片破碎、折叠等情况。切好的切片要放在载玻片上，然后进行烤片处理，烤片的温度和时间要适中，一般在 60℃左右烤片 2 - 3 小时，使切片牢固地附着在载玻片上。烤片的目的是防止后续染色过程中切片脱落。此外，在切片制作过程中，要注意保持切片机和载玻片的清洁，避免污染切片，影响后续的染色结果。
脱蜡和水化是为了使组织中的抗原能够充分暴露，便于抗体结合。由于切片是包埋在石蜡中的，石蜡会阻碍抗体与抗原的结合，因此需要先进行脱蜡处理。通常使用二甲苯进行脱蜡，将切片依次放入不同缸的二甲苯中浸泡，一般进行 2 - 3 次，每次 5 - 10 分钟，确保石蜡完全去除。脱蜡后要进行水化处理，通过梯度酒精从高浓度到低浓度依次浸泡，使组织逐渐恢复到含水状态。水化的目的是为了使组织能够更好地与后续的试剂接触，提高染色效果。水化过程要注意酒精的浓度梯度和浸泡时间，避免组织过度水化或脱水。
抗原修复是免疫组化中的关键步骤，因为在组织固定和处理过程中，抗原的结构可能会被破坏，导致抗体无法与抗原有效结合。抗原修复的方法有多种，常见的有热修复和酶消化修复。热修复又分为微波修复、高压修复等。微波修复是将切片放入装有抗原修复液的容器中，在微波炉中加热至沸腾，然后保持一定时间，一般为 10 - 15 分钟。高压修复则是利用高压锅内的高温高压环境进行抗原修复，时间相对较短，一般为 3 - 5 分钟。酶消化修复是使用蛋白酶等酶类对切片进行消化处理，使抗原暴露。选择哪种抗原修复方法要根据抗原的性质和组织类型而定。抗原修复后要进行充分的冲洗，去除修复液，为后续的抗体孵育做好准备。
抗体孵育是免疫组化的核心步骤，分为一抗孵育和二抗孵育。一抗是针对目标抗原的特异性抗体，将一抗滴加在切片上，放入湿盒中在适宜的温度下孵育，一般在 37℃孵育 1 - 2 小时或 4℃过夜。孵育温度和时间要根据抗体的说明书进行调整。孵育后要进行充分的冲洗，去除未结合的一抗。二抗是能够与一抗结合的抗体，通常带有标记物，如酶或荧光素。二抗孵育的条件与一抗类似，孵育后同样要进行冲洗。显色是利用标记物的特性使抗原所在部位显色。如果二抗标记的是酶，如辣根过氧化物酶，就需要加入相应的底物，如 DAB，在酶的作用下底物发生化学反应，产生棕色沉淀，从而显示出抗原的位置。显色时间要根据显色情况进行控制，避免显色过深或过浅。最后进行复染、脱水、透明和封片等处理，以便在显微镜下观察。
